中华鳖(Trionyx sinensis)，分类学上隶属爬行纲(Repitlia)、龟鳖目(Tesmdinata)、鳖科(Trionychidae)、鳖属(Trionyx)。俗名鳖、团鱼、王八等。除西藏、青海和新疆外，其它地区均有分布，以长江流域和华南地区为多见(王培潮, 2000, 中国的龟鳖, pp.50-56)；国外主要分布于朝鲜、日本和越南(杨渡远等, 1997, 中国龟鳖类原色图谱, pp.48)。近年来，由于食用、药用等的大量需求，中华鳖的养殖业发展迅猛，其养殖方式主要有鱼鳖混养、池塘单养、工厂化温室养殖等，其年产量突破了20万t (中华人民共和国农业部渔业局, 2010, 中国渔业统计年鉴, pp.27)。伴随着养殖业的发展，中华鳖种群混杂导致种群间的分化、变异逐渐被人为湮灭，其种群的遗传多样性受到了很大的影响。刘至治等(2004)应用RAPD分析了中华鳖五群体的遗传变异，认为遗传多样性较丰富；肖亚梅等(2005)研究得出中华鳖群体内的遗传变异率0.227，为遗传共享度较高的群体；张志允等(2011)对中华鳖黄河群体选育世代F₁、F₂及F₃遗传变异进行了微卫星分析，结果表明群体内存在丰富可供选育用的遗传多样性基础，随着选育代数的增加而明显降低，证明以生长、体色和体型等表型指标为直观选育指标的群体选育，对遗传型指标产生了可检测到的影响。

遗传多样性大小是物种长期进化的产物，是其生存适应和发展进化的前提。一个居群或物种遗传多样性越高或遗传变异越丰富，对环境变化的适应能力就越强。了解物种的遗传变异，有利于对其种质资源的管理保护和开发利用。因此，本研究利用微卫星标记对5个养殖种群中华鳖的遗传多样性及种群间的分化进行分析，以期为中华鳖的种质资源保护以及改良育种工作提供理论依据。

1结果与分析
1.1微卫星扩增结果
试验所用11对微卫星引物均能在所有DNA样品中稳定地扩增出相应条带(图1)。各微卫星引物在5个群体150个个体中的等位基因数为3~6个，平均等位基因数为4.1818，平均有效等位基因数为2.2293，扩增片段大小在108~246之间。洞庭(DT)、黄河(HH)、黄沙(HS)、日本(RB)以及绿卡(LK)在各个位点的等位基因数及有效等位基因数见表1。各个群体的平均有效等位基因数、平均等位基因数、平均观测杂合度、平均期望杂合度以及平均多态信息含量如表2所示。

图1引物P-04和PS-04在中华鳖五个群体部分个体中的扩增带谱 Figure 1 The example of band pattern amplified by primers of P-04 and PS-04 in Trionyx sinensis

表1中华鳖5个群体11个微卫星位点的遗传多样性参数 Table 1 The parameters of genetic diversity of five populations of Trionyx sinensis at 11 microsatellite loci

表2中华鳖5个群体的平均遗传多样性参数 Table 2 The average value of genetic diversity parameters of five populations of Trionyx sinensis

1.2遗传多样性分析
11个位点中P-05、P-O6、P-12、P-11、P-12和PS-04位点的多态信息含量(PIC)小于0.5，为中度或者低度多态，其余位点均为高度多态，说明微卫星引物多态性较好，可以用于遗传多样性分析。根据每个位点的等位基因频率，计算反映群体遗传多样性的有效等位基因数、观测杂合度、期望杂合度以及多态信息含量，其平均数值范围分别为2.0189~2.3969、0.4333~0.5545、0.4278~0.5274和0.4020~0.4660。平均有效等位基因数、平均观测杂合度、平均期望杂合度以及平均多态信息含量均为杂交种群绿卡(LK)的最高，分别为2.3969、0.5545、0.5274和0.4660；而以日本(RB)种群的最低，分别为2.0198、0.4333、0.4278和0.4020。这些指标的分析结果表明绿卡(LK)的遗传多样性最高，洞庭、黄河和黄沙次之，日本(RB)的遗传多样性最低。

1.3群体间遗传结构分析
通过对5个群体中华鳖进行F-检验(表3)，结果显示洞庭(DT)和日本(RB)的遗传分化指数最大(FST=0.0969)，而洞庭(DT)和黄河(HH)的分化指数最小(FST=0.0233)。遗传相似率和遗传距离如表4。根据亲本与子代间的遗传距离，采用UPGMA法构建子代与亲本的系统进化树(图2)，由图可知，黄河(HH)和洞庭(DT)先聚为一支，然后与其子代绿卡(LK)聚合，再与黄沙(HS)聚合，最后才与日本(RB)聚合。

表3中华鳖5个种群的F-统计量(FST) Table 3 Pairwise F-statistics estimates among five populations of Trionyx sinensis

表4 中华鳖5个种群遗传相似系数与遗传距离 Table 4 Genetic similarity and genetic distance of five populations of Trionyx sinensis

图2中华鳖5个种群UPGMA聚类分析图 Figure 2 Dendrogram of five populations of Trionyx sinensis based on genetic distance using UPGMA method

2讨论
2.1中华鳖5个群体的遗传多样性
多态信息含量(PIC)是群体内遗传变异的量度，可以用来描述微卫星位点的变异程度。依Botstein等的划分标准：当PIC>0.5时，该位点为高度多态位点；当0.25<PIC<0.5时，为中度多态性位点；当PIC<0.25时，为低度多态位点。本研究的结果显示，中华鳖5个种群的多态信息含量都处于中度水平，只有洞庭(DT)和黄河(HH)的杂交种绿卡(LK)的最高，为0.466 0，接近0.5属于中度水平。吉磊等(2011)对卵形鲳鰺3个养殖群体的微卫星多态性进行分析发现养殖群体的多态信息含量都处于0.5左右，属于中度接近高度多态水平；蔡磊等(2012)对大口黑鲈北方亚种和佛罗里达亚种及其杂交子代进行遗传分析，其北方亚种和佛罗里达亚种的多态信息含量(PIC)分别为0.4506和0.4652，同样低于0.5。分析原因有二，一是采样问题，因为本实验的采样都是于良种场，都是经过了有意图定向选育的后代，多态含量肯定会有所下降，这跟张海琪等(2011)运用RAPD对培育的中华鳖新品种日本品系和清溪乌鳖的遗传多样性分析结果类似；二是微卫星引物的选取也会影响到PIC值的大小，因为有几对引物扩增的结果显示此位点的等位基因数极少且稳定，为保守位点，可能是中华鳖进化过程中最原始最保守的一部分等位基因，对于维持中华鳖物种的稳定有着重要的意义。

2.2中华鳖5个群体的遗传分化
遗传相似系数是衡量群体间遗传变异程度的可靠参数，群体间亲缘关系越近，则遗传变异性越低，相似系数值越大(Plotsky et al., 1993)。本研究基于微卫星分析结果建立的系统进化树显示黄河(HH)和洞庭(DT)的亲缘关系最近，绿卡(LK)为二者的杂交种，亲缘关系与二者也很近，而黄沙(HS)和日本(RB)的相对比较远，最远的为日本(RB)群体。洞庭(DT)与黄河(HH)先聚类然后才与其杂交子代绿卡(LK)聚合，理论上应该是绿卡(LK)先和其父母本中一个种群聚合然后才与另外一个聚合。分析原因可能是选用的微卫星引物不够多或者采样不均匀造成的，也可能子代在双亲的基因融合过程中产生了新的变异。另外，遗传固定指数(FST )值是衡量群体间遗传分化程度的重要参数。从5个群体间来看，群体间FST介于0.0233~0.0969之间，属于低等程度的遗传分化，表明这5个群体并未产生明显的遗传分化。这种低等程度的分化也许与上世纪90年代中华鳖养殖业蓬勃发展、全国大范围互相引种导致群体间的混杂有关。

2.3杂种优势现象
杂种优势是指两个或几个遗传不同的亲本杂交所产生的杂种在生长势、抗逆性和品质等方面优于其亲本的现象。绿卡中华鳖为广东绿卡实业有限公司国家级中华鳖良种场培育出来的优质品系，其苗种生长均一、规格整齐、成活率高、养成商品个体大，发病少。绿卡(LK)为以洞庭(DT)为母本，黄河(HH)为父本的杂交F1代，从本研究结果可以看出，与其它4个群体比，其平均有效等位基因数、平均期望杂合度、平均观测杂合度和平均多态信息含量均为最高。一般来说，种内亲本间的遗传距离越大，其子代基因型的杂合度越高，杂种优势越强。陈国华等(2006)对红鳍笛鲷 ♀×千年笛鲷♂杂交种观察发现，其生长速度、抗逆性等方面表现出较好的杂种优势，且其多态信息含量和杂合度等数据均高于2亲本；李学军等(2008)对萨罗罗非鱼与尼罗罗非鱼正反杂交子代进行微卫星分析，其正交子代尼萨罗非鱼的多样性也表现为大于2亲本。这些都与本实验的结果相类似。

3材料与方法
3.1实验材料
本实验所需要的洞庭(DT)、黄河(HH)、绿卡(LK)和日本(RB)鳖都是由广东绿卡实业有限公司提供，各30只，都为稚鳖，体重约为4~5 g；而黄沙(HS)鳖采集于广西桂平金田镇，体重为8~15 g，30只。对150只稚鳖进行解剖取其肝脏，编号置于酒精中于-20℃保存备用。

3.2基因组DNA的提取
参照北京天根动物基因组DNA抽提试剂盒说明书的方法提取样品基因组DNA。并用8 mg/mL (0.8%)的琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，用紫外分光光度计测定OD₂₆₀和OD₂₈₀，取出部分DNA样品将浓度调至50 ng/μL，保存于-20℃备用。

3.3微卫星引物
11对引物(表5)皆来自文献(张志允等, 2011; 魏振邦等, 2008)，所有引物均由上海英潍捷基有限公司合成。

表5引物序列及扩增温度 Table 5 Primer sequences and annealing temperatures

3.4 PCR扩增及产物检测
PCR反应的总体系为20 µL：50 ng的基因组DNA, 10×buffer 2 μL, MgCL₂ (25 mmol/L) 1.8 μL，4×dNTP (10 μmol/L) 0.5 μL，上、下游引物(20 pmol/L)各0.5 μL，Taq酶1 U。PCR反应程序为：94℃预变性5 min；94℃30 s，退火(退火温度依引物而定) 30 s，72℃ 30 s，30个循环；72℃延伸10 min。PCR产物在10%的非变性聚丙烯酰胺凝胶中分离，硝酸银染色。

3.5数据统计分析
利用Popgene32 (Version 1.31)软件统计分析微卫星基因座的等位基因数(Na)、有效等位基因数(Ne)、观测杂合度(HO)、期望杂合度(HE)、χ²检验Hardy-Weinberg平衡、遗传分化指数F-统计量(F-statistics, FST)及Nei’s标准遗传距离(Ds) (Nei, 1978)。根据Botstein等(1980)的方法计算每个微卫星位点的多态信息含量(PIC)。应用软件MEGA 4.0采用UPGMA法进行聚类分析，以分析亲缘关系。

作者贡献
本论文第一作者刘阳对研究进行实施、数据整理以及论文撰写。通讯作者朱新平对研究进行设计、指导和论文审核修改。史燕、赵建、洪孝友参与本研究的采样、数据分析等具体工作，周贵谭为本实验提供了宝贵的样品。
 
参考文献
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